当今生命科学研究中，以高时空分辨率捕捉活细胞精细结构的三维动态，是解析复杂生命过程的重要基础。光片显微镜兼具高速、低光毒和三维成像优势，但空间分辨率仍受衍射极限制约。如何进一步突破光片显微成像的空间分辨率瓶颈，实现亚细胞尺度的三维动态观测，是深入揭示生命活动规律的关键。

9月28日，清华大学生命科学学院李栋教授课题组在《自然·光子学》（Nature Photonics）上发表题为“晶格光片激活结构光照明超分辨显微镜”（Lattice light sheet activation structured illumination super-resolution microscopy，LA-SIM）的长文（Article）。该工作通过光学成像前端与智能计算后端协同突破现有瓶颈，将三维超分辨观测从单细胞拓展至完整早期胚胎，为研究亚细胞精细结构及其长时程动态观测提供了新的工具。

LA-SIM的关键设计是将观测层选择与结构照明超分辨分步实施。该研究首先利用405 nm晶格光片选择性激活探测焦平面附近的可逆光开关荧光蛋白（rsFP），使目标层以外的分子保持关闭状态，从而获得三维成像必须的光层切能力；随后，可通过引入具有中央零强度区域的488 nm光场，选择性关闭已激活薄层两侧的分子，进一步压缩轴向发光范围。在读取阶段，经探测物镜引入互补的488 nm结构照明，充分利用其数值孔径获得高空间频率调制，并在采集荧光信号的同时使分子返回关闭状态。该方案将光片（light sheet）成像的光学层切能力与SIM的高空间频率调制能力有机融合，在保留光片成像优势的同时，实现三维超分辨成像。

图1. LA-SIM成像流程及活细胞成像效果展示

这一独特的光学设计赋予LA-SIM多方面优势。首先，在每个选定的激活层中， 0相位和π相位两组互补照明可产生两幅具有独立噪声特性的LA-SIM图像，天然适用于Noise2Noise自监督去噪。 团队进一步将这一特性引入自主提出的合理化深度学习（rDL）框架，构建了一种具有高保真度的自监督图像增强方法，有效缓解rsFP荧光亮度有限及光开关疲劳带来的成像时程限制，实现低信噪比条件下的高质量超分辨重建，并进一步延长活细胞成像时程。其次，如果对两组互补照明图案分配不均衡的488 nm照明剂量，则rsFP关闭过程中的非线性响应将引入高阶调制频率，从而实现非线性结构光照明超分辨成像（NLSIM），进一步突破传统SIM的2倍分辨率提升限制。在非线性SIM模式下，团队最高实现了横向约87 nm、轴向约203 nm的光学分辨率。

为进一步缓解rsFP在标记颜色与长时程成像方面的限制，团队开发三维Transformer超分辨模型SRFormer-pMoE，将高质量rDL LA-SIM数据所提供的具有真实光学分辨率提升的超分辨结构信息迁移至常规晶格光片图像重建。SRFormer-pMoE融合三维空间与通道注意力机制、空间频率信息融合及多尺度特征提取，并引入图像块级混合专家机制（pMoE）。模型包含约12亿可训练参数，推理时仅激活约13%，兼顾计算效率与三维重建质量。在五类代表性生物结构测试中，该模型表现出优于分别针对单一结构训练的3D-RCAN模型的重建性能。研究还通过跨光谱通道测试评估其适用性，并引入贝叶斯学习与蒙特卡洛Dropout生成置信度图，为超分辨推断结果的可靠性评估提供辅助依据。

图2. SRFormer-pMoE网络架构及三色活细胞长时程超分辨成像

SRFormer-pMoE作为宽场光片采集与计算超分辨推断的桥梁，保留了常规光片模式的采集速度及多色标记兼容性，极大拓展了LA-SIM的应用范围。研究展示了约74分钟、近700个时间点的三色活细胞超分辨成像，追踪了微管网络及相关细胞器的动态互作，并进一步利用该体系观察到运动中的溶酶体切割应激颗粒的动态过程。在多细胞厚样品成像中，利用样本表层的高质量rDL LA-SIM数据微调模型，并采用扫描激发与滚动快门相结合的电子共聚焦狭缝探测，可有效抑制散射背景，提升深层成像质量。在完整八细胞期小鼠胚胎中，团队实现了超过2.5小时的长时程观测，首次以三维超分辨成像性能观察到单个溶酶体的融合与分裂；进一步在秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎中观察到细胞融合过程中顶端连接的逐步解体，并捕捉到胚胎抽动阶段的快速运动。上述结果展现了该方法解析多细胞生物发育过程中精细结构变化与动态行为的能力。

图3. 溶酶体–应激颗粒相互作用及小鼠胚胎溶酶体的长时程三维超分辨成像

该研究通过光学成像前端与智能计算后端的协同创新，突破了三维超分辨活细胞成像在速度、时程和多色兼容性等方面的限制，进一步拓展了LA-SIM的成像能力与应用边界，推动其从技术方法创新迈向复杂生物体系研究的实际科研应用。清华大学膜生物学全国重点实验室助理研究员董学、清华大学生命学院博士后孟权、中国科学院生物物理研究所2025届博士毕业生杨晓雨、博士后陈浩宇、清华大学精仪系助理教授乔畅为本文共同第一作者，清华大学生命学院李栋教授为本文通讯作者。本研究得到了科技部、国家自然科学基金委员会以及新基石科学基金会的资助。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41566-026-02019-6